MİKROBİYOLOJİNİN GÖZ BEBEĞİ: GRAM BOYAMA

Laboratuvarlarda sıkça kullanılan mikroorganizma boyama tekniklerinin amacı genel olarak bakterileri mikroskop altında daha görünür ve incelenebilir hale getirmektir. Mikrobiyolojide bunu gerçekleştirebilecek birçok boyama tekniği bulunuyor. Metilen mavisiyle boyama, gram boyama ve Ziehl Neelsen metodu bunlara örnek olarak verilebilir. Bunlardan ilki bakterilerin sadece morfolojisi hakkında fikir sahibi olmamızı sağlıyor. Buna karşın diğer ikisi, bakteri morfolojisine ek olarak hücre yapısı ve duvarının kimyasal özelliklerinin belirlenmesini de sağlıyor. Yazının ilerleyen bölümlerinde gram boyama yöntemi üzerinde duracağız ve bu tekniği kullanarak inceleyeceğimiz iki farklı bakterinin gram pozitif mi yoksa gram negatif mi olduğunu saptayacağız . Çalışma kapsamında inceleyeceğimiz iki bakteri Bacillus subtilis ve Escherichia coli olacak.

GENEL BİLGİ

İlk kez 1884 yılında Danimarkalı bilim insanı Christian GRAM tarafından geliştirilmiştir. Boyama yöntemi de adını buradan alıyor. Bu yönteme göre bakteriler iki gruba ayrılır: Gram(+) ve Gram(-). Bakterilerin bu gruplardan birine dahil olmaları, alkol ile renk giderimi işlemi boyunca kristal viyole boyasının mor renginin korunması veya kaybolmasına dayanır. Boyama sürecinin sonunda bakteri mikroskop altında mor renkte görülüyorsa o bakterinin gram(+), eğer pembe-kırmızı renkte görülüyorsa da bakterinin gram(-) olduğu anlaşılır. Bu farklılığın sebebi renk giderici solventlere (çözücüler) karşı iki grubun farklı permeabilite (geçirimlilik) göstermesidir.

GRAM BOYAMANIN BASAMAKLARI

1. aşama: Preparat kristal viyole ile boyanır.( 1 dk) …………. tüm hücreler mor renkte görülür.
2. aşama: Lugol çözeltisi ile muamele edilir.(1 dk)……………tüm hücreler mor renkte görülür.
3. aşama: Alkol ile dekolarizasyon (15 sn)…………….gram(+) hücreler mor, gram(-) hücreler renksiz görülür.
4. aşama: Bazik fuksin ile boyama(30 sn)….. gram(+) hücreler mor, gram(-) hücreler pembe-kırmızı görülür.

Yazının başında da belirtildiği gibi mikroorganizmaların boyanması için gram boyama yönteminden başka yöntemler de mevcut. Maya formunda üreyen funguslar boyanacağında genellikle metilen mavisi tercih edilir. Aside dirençli bakteriler ve bakteri sporları boyanacağında ise genellikle Ziehl Neelsen metodu tercih edilir.

Bakterilerin gram özelliklerine göre gram(+) ya da gram(-) olarak ayrıldıklarına değinmiştik. Morfolojik özelliklerine göre ise dört gruba ayrılırlar: basil (çomak), kokobasil, kok (yuvarlak) ve spiral (kıvrık).

Gram(+) ve gram(-) şeklinde bir ayrım, bakterilerin hücre duvarlarının yapısal farklılıklarından kaynaklanıyor.

BAKTERİLERİN YAPISAL FARKLILIKLARI

Gram pozitif bakteri hücre duvarında lipopolisakkarit protein tabaka bulunmaz. buna karşın gram negatif bakterilerin hücre duvarında bulunur.

Gram pozitif bakterilerin hücre duvarında teikoik asit bulunmasına rağmen gram negatiflerde bulunmaz.

Gram pozitif bakterilerin hücre duvarında mürein tabaka (peptidoglikan tabaka) daha kalındır. Gram negatif bakterilerde daha incedir.

MÜREİN TABAKA ( PEPTİDOGLİKAN )

Mürein tabakasını oluşturan temel yapılar glikan ve peptid zincirleridir. Glikan zincirinin oluşabilmesi için N-asetilglukozamin (N.A.G.A) ve N-asetilmuramik asit (N.A.M.A) gibi şeker türevlerinin Beta 1-4 glukozidik bağlar ile polimerize olması gerekir. Bu glikan zincirleri de birbirlerine peptid köprüleriyle bağlanarak sert peptidoglikan tabaka oluşturulmuş olur. Bakteride peptidoglikan tabaka sentezlenirken N-asetilmuramik asite bağlı pentapeptitteki subterminal D-alaninin karboksil grubu ile pentaglisin ara peptid köprüsündeki glisinin amino grubu arasında amid bağı meydana gelir. Bakteride bulunan karboksipeptidaz enzimi bu amid bağının oluşturulmasında önemli rol oynar.

HÜCRE DUVARI

Bakterilerin gram özellikleri bakterinin sahip olduğu hücre duvarının kimyasal özellikleriyle alakalıdır. Peki bu hücre duvarının başlıca işlevleri nelerdir?

1. Hücre bölünmesinde rol oynar.
2. Hücrenin şekil kazanmasını sağlar.
3. Hücreyi ozmotik lizise karşı hücreyi korur.
4. Hücrenin içine ve dışına madde geçişini kontrol eder.

BOYALAR

Gram boyama deneyinde kullanılan boyalara ve bunların hazırlanışına geçmeden önce birtakım boyaların listesine göz atalım.

Bazik boyalar (katyonik):

1. Tionin
2. Lugol
3. Hematoksilen
4. Auramin
5. Bazik fuksin
6. Metil viyole
7. Safranin
8. Kristal viyole
9. Metilen mavisi

Nötral Boyalar:

1. Giemsa
2. Leishman
3. Wright’s

Asidik Boyalar (anyonik):

1. Floksin
2. Kongo kırmızısı
3. Pikrik asit
4. Maloşit Yeşili
5. Eosin
6. Asit fuksin
7. Nigrosin
8. Çini mürekkebi

GRAM BOYAMADA KULLANILAN BOYALAR VE HAZIRLANIŞI

Bu yöntemde bazik boyalar listesinde olan kristal viyole, lugol ve bazik fuksin kullanılıyor.

Lugol Boyasının Hazırlanışı:

İyot…………………………………………. 1 gr

Distile su………………………………… 300 ml

KI (potasyum iyodür)………………2 gr

Kristal Viyole Boyasının Hazırlanışı:

Distile su………………………100 ml

Kristal Viyole………………..0,5 gr

Bazik Fuksin Boyasının Hazırlanışı:

Etil Alkol……………………. 100 ml

Bazik Fuksin………………3 gr

Boyalar havanda iyice öğütüldükten sonra 48 saat etüvde bekletilmek üzere yavaşça renkli şişeye boşaltılır.

Gram boyama deneyini iki kısma ayırarak ilerleyelim.

→Preparat hazırlama işlemi

→Gram boyama işlemi

PREPARAT HAZIRLAMA İŞLEMİ

1. Bakteri lamın hangi yüzüne süspanse edilecekse diğer yüzüne cam kalemiyle bir işaret koyulmalıdır. Bu sayede bakterileri boyarken lamın yanlış yüzünü boyamaktan kaçınabiliriz.
2. Bakterileri lam üzerine almadan önce serçe parmak yardımıyla bir damla su lam yüzeyine damlatılır.
3. Laboratuvarda bazı gruplar gram pozitif (Bacillus subtilis), diğer gruplar ise gram negatif (E. coli) bakterileri kullanırlar. Hangi bakteri kültürü kullanılıyorsa o kültür lam üzerinde suda süspanse edilerek yayma yapılır.
4. Süspansiyon işleminden sonra lam, kuruması için bekletilir.
5. Hazırlanan preparat bunzen beki ateşi üzerinden üç defa ekmek keser gibi geçirilir. Bu esnada lam, bakteri yayılan kısmı üst tarafa bakacak şekilde tutulmalıdır. Lamın ateşten geçirilmesinin sebebi bakterileri lama sabitlemek ve boyama işlemleri sırasında boyayla birlikte bakterilerin de akıp gitmesini önlemektir. Bu işlem fiksasyon olarak adlandırılır.

GRAM BOYAMA İŞLEMİ

• Bakterilerin yayıldığı lam yüzeyine, lamı kaplayacak miktarda kristal viyole damlatılır. Bir dakika bekletilir ve su ile yıkanır.
• Aynı lamın üzerine bu kez lugol damlatılır. Bir dakika bekletilir ve su ile yıkanır.
• Bazik fuksin ile boyamadan evvel lama alkol damlatılır. 15 saniye bekletilir ve suyla yıkanır.
• Lama son olarak bazik fuksin damlatılır ve 30 saniye bekletilir. Su ile yıkanır.
• Kurutma kağıdı yardımıyla kurutulur.
• Mikroskop altında incelemelere, immersiyon yağı damlatılarak 100’lük immersiyon objektiflerinde başlanmalıdır. İmmersiyon yağı damlatılarak mikroskop ışığının kırılma indisi ayarlanır. Bu sayede ışığın odaklanması sağlanır.