MİKROBİYOLOJİK ÖRNEK ALIMI VE KÜLTÜR HAZIRLANMASI – EKİM TEKNİKLERİ

Bu yazımızda mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılan örnek alma teknikleri ve ekim yapma yöntemleri üzerinde duracağız. Detaylı anlatıma geçmeden önce konuya hakim olmayı kolaylaştırmak adına birkaç kavramın ne anlama geldiğine bir göz atalım.

Kültür: İçinde ya da üzerinde istenilen mikroorganizmaların üretildiği besiyerlerine kültür denir.

Kültürasyon: Mikroorganizmaların bulundukları ortamdan doğru yöntemlerle alınarak uygun ve steril besiyeri ortamına aktarılması ve geliştirilmesi işlemine denir.

İnokülasyon: İncelenecek mikroorganizmaların steril bir besiyerine (içine ya da üzerine) ekim yöntemlerinden yararlanılarak aktarma işlemine inokülasyon denir. Ekim ve aşılama ile aynı anlama gelir.

İzolasyon: Karışık halde bulunan mikroorganizmaların içinden istenilen mikroorganizmayı ayırarak saf halde elde etmektir. Mikroorganizmalar doğada nadiren saf halde bulunurlar.

İdentifikasyon: İzole edilen bir mikroorganizmanın kim olduğunun cins, tür veya serotipinin saptanması olayıdır. Tanıma anlamına gelir.

Kontaminasyon: Besiyeri ortamında bulunması ve üremesi istenmeyen mikroorganizmaların, kirlerin ve atıkların steril besiyerine bulaşması ya da hastalık yapıcı bir mikroorganizmanın (patojen) canlıları enfekte etmesi olayıdır.

İnkübasyon: Ekimi yapılan besiyerlerinin etüvde belli sıcaklık derecelerinde – bu sıcaklık mikroorganizmaların üreyebileceği optimum sıcaklıktır- belli sürelerde tutulmasıdır. Bu sayede mikroorganizmanın üreyebilmesi için uygun koşullar sağlanmış olur.

KÜLTÜR TİPLERİ:

Saf Kültür: Besiyerinde sadece tek bir mikroorganizma türü üretilmiş kültürler saf kültürdür. Mikroorganizmaların karakterlerinin ve diğer bazı özelliklerinin tanınması hedeflendiğinde karışık olarak üretilmedikleri bu kültür kullanılır.

Karışık Kültür: Aynı besiyerinde birden fazla çeşitte mikroorganizma üretilmişse buna karışık kültür denir. Karışık kültür elde etmek için özel bir tekniğe ihtiyaç yoktur. Mikroorganizma içeren örneklerden besiyerine ekim yapmak birçok mikroorganizmanın bir arada üremesini zaten sağlayacaktır.

Sıvı Kültür: Petri kabında ya da tüpte hazırlanabilen, sıvı haldeki besiyerinde geliştirilip üretilen kültürlerdir.

Katı Kültür: Petri kabında ya da tüpte hazırlanabilen, katı besiyerine (agar içeren) üretilen kültürlerdir. Agarlı besiyeri bileşimi farklı isimlerle karşınıza çıkabilir. Bu isimler besiyerinin hazırlanması ve örneğin ekim şekline göre belirlenir.

İNOKÜLASYONDA KULLANILAN ALETLER:

Bunzen Beki: Isıtma, sterilizasyon ve yanma işlemleri için kullanılır. İnokülasyon sırasında bunzen beki alevi, ateşin etki alanını ve ekim alanını sterilize eder. Olabildiğince ateşe yakın çalışılır. Çalışma yapan kişinin yanmayacağı fakat herhangi bir kontaminasyonun engellenebileceği bir mesafe özenle ayarlanmalıdır.

Pipet ve Pipetlik: Pipetlerin ağız bölgesinde pamuk tampon yer alır. Sterilize edileceğinde pipetlik içerisine yerleştirilip pasteur fırınına konulur. Besiyerine ekimi yapılacak örnekler, sıvı kültürlerden alınacağında kullanılır. Pipetler inokülasyon sonrasında herhangi bir yüzeye ya da alete değdirilmeden lavaboya veya dezenfektan bir solüsyona konulmalıdır.

Eküvyon: Uç kısmında pamuk bulunan tahtadan yapılmış bir çubuktur. Sterilize edileceğinde bir tüp içerisinde ve tüpün ağız kısmına pamukla sabitlenip pasteur fırınında bekletilir. Örnek almak için kullanılır.

Öze: İnokülasyonda kullanılan en temel malzemedir. Üç kısımdan oluşur: ısıya dayanıklı, paslanmaz bir tel, vida ve sap kısmı. 6-7 cm boyundaki öze, ekim sırasında sap kısmından kalem tutarcasına tutulur. Özenin üç kısmı da bunzen beki alevinde sterilize edilir. Ekim sonrasında tekrar sterilize edilmelidir. Kullanılacak ekim tekniğine göre özenin ucu düz veya yuvarlak olabilir.

Steril Besiyerleri ve Kültürler: Sıvı veya katı olabilirler. Katılar petride ve tüpte, sıvılar erlende ve tüpte bulunabilir. Erlen ve tüplerin ağız kısmı gazlı bez ve pamuktan oluşan bir tampon ile kapalı tutulur. Mikroorganizmanın türü, cinsi, ekim tarihi gibi bilgiler kültürlerin üzerinde belirtilir.

KÜLTÜRDEN STERİL BESİYERLERİNE EKİMİN AŞAMALARI:

  1. Örnek alınacak kültürün belirlenmesi
  2. Ekimi yapılacak besiyerinin seçilmesi
  3. Özenin sterilize edilmesi
  4. Kültürün tamponunun çıkartılması
  5. Kültürün ağız kısmının benzen beki alevinden geçirilmesi
  6. Bunzen bekinde ısıtılan özenin bir miktar soğutulması
  7. Öze ile örneğin alınması
  8. Tampon tekrar takılmadan önce kültürün ağız kısmının ateşten geçirilmesi
  9. Besiyerinin tamponunun çıkarılıp ağız kısmının ateşe tutulması
  10. Besiyerine öze yardımıyla ekim yapılması
  11. Besiyerine tampon tekrar takılmadan ağız kısmının ateşten geçirilmesi
  12. Özenin bunzen bekinde sterilize edilmesi
  13. Etiketleme yapılması

DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN KURALLAR

İnokülasyon sırasında laboratuvarda önlükle çalışmak gerekir. Ekim yapılırken seri hareket edilmeli, beklenilmemeli ve konuşulmamalıdır. Bu sayede kontaminasyon önlenir. Ekim sırasında bir elde kültür diğer elde öze ( veya pipet) yer alır. Kültürün tamponu, özeyi tutan elin küçük parmağı yardımıyla çıkartılır. Bunzen bekinde ısıtılan öze, kültürün içinde camın çeperinde soğutulur. Sıvı besiyerleri, inokülasyon öncesi ve sonrasında yatık halde bırakılmaz. Eğer mikroorganizma ekimi sıvı besiyerine yapıldıysa, ekim sonrasında tüpün birkaç saniye çalkalanması gerekebilir.

EKİM TEKNİKLERİ

Genel olarak dört farklı şekilde ekim yapılabilir:

  1. Sıvı kültürden sıvı besiyerine inokülasyon
  2. Sıvı kültürden katı besiyerine inokülayon
  3. Katı kültürden katı besiyerine inokülasyon
  4. Katı kültürden sıvı besiyerine inokülasyon

sıvı kültür →özeyle (yuvarlak uçlu) →zikzak ekim tekniği → katı besiyeri

sıvı kültür → özeyle (yuvarlak uçlu) → tek koloni ekim tekniği → katı besiyeri

sıvı kültür → pipetle yayma tekniği → katı besiyeri

sıvı kültür → özeyle (yuvarlak uçlu) → homojen süspansiyon → sıvı besiyeri

sıvı kültür → pipetle → homojen süspansiyon → sıvı besiyeri

katı kültür → özeyle ( yuvarlak uçlu) → zikzak ekim tekniği → katı besiyeri

katı kültür → özeyle (iğne uçlu) → batırma ekim tekniği → katı besiyeri

katı kültür → özeyle (yuvarlak uçlu) → tek koloni ekim tekniği → katı besiyeri

katı kültür → özeyle (yuvarlak uçlu) → homojen süspansiyon → sıvı besiyeri

Şimdi bu ekim tekniklerine yakından bakalım.

  1. Yayma ekim tekniği: plak yüzeyine yaygın ekimde amaç mikroorganizmaların tüm yüzeyinde üremesini sağlamaktır. Bu ekim tekniğinde besiyeri yüzeyinin kuruluk ve nemlilik miktarı iyi ayarlanmalıdır. Yüzeyin çok nemli veya kuru olması besiyerine ekim yapılmasını engeller. Sıvı kültürden pipetle 0,1 ml örnek petrinin ortasına bırakılır. Özenin uç kısmı L haline getirilir. Öze sterilize edildikten sonra besiyerinde soğutulur. Ardından merkezden başlayarak çepere doğru yayma yapılır. Besiyerinin parçalanmasını önlemek için ekim sırasında özeyi fazla bastırmamak gerekir.
  2. Batırma ekim tekniği: Bu ekim tekniğinde iğne öze kullanılır. Tüpte dik konumda dondurulmuş besiyerine, ekilecek mikroorganizmaları taşıyan iğne öze dik biçimde batırılır ve geri çekilir. Bu esnada özenin besiyeri dışında hiçbir yere temas etmediğinden emin olunmalıdır.. Mikroorganizmalar inkübasyonun ardından batırma çizgisi boyunca üreme gösterirler.
  3. Zikzak ekim tekniği: Ekim örneğinde az miktarda mikroorganizma bulunduğu durumlarda tercih edilen bir ekim tekniğidir. Öze, tüpün dip kısmından ağız kısmına doğru zikzak çizilerek hareket ettirilir.
  4. Homojen süspansiyon tekniği: Eğer katı kültürden örnek alınıyorsa örnek öncelikle besiyerinin cam ile birleştiği kısımda cama sürülür. Ardından besiyerine karıştırılıp tüp bir süre çalkalanır. Örnek eğer sıvı kültürden alınıyorsa özenin uç kısmında zar benzeri bir yapı meydana gelir. Öze direkt sıvı besiyerine batırılıp geri çekilir. Ardından tüp çalkalanır ve ekim işlemi tamamlanmış olur.
  5. Tek koloni ekim tekniği: Tek koloni ekimi yapılacağında petride geniş yüzeyli besiyeri tercih edilir. İnkübasyona bırakılan mikroorganizma hücrelerinin ayrı ayrı gelişip koloni oluşturabilmesi için mikroorganizmaların geniş yüzeye yayılabilmesi önemlidir. Bakteriler petri kabına belirli aralıkta ekilir. Bu sayede tek tek düşüp ayrı koloniler meydana getirebilirler. ortamda bulunan bakterilerin birbirlerinden farklılığı, onların oluşturduğu kolonilerin morfolojilerini de farklılaştırır. Koloni morfolojisinden kastettiğimiz aslında koloninin matlığı, şeffaflığı, rengi, şekli, çapı, kenar yapısı, yapışkan görünümü gibi özelliklerdir. Bu özellikler sayesinde bakteri kolonileri birbirinden ayrı belirlenir.. Öze yardımıyla bu belirlenen mikroorganizma steril besiyerine ekilerek saf kültür elde edilir. Bu işlemlerin ardından tanımlama (identifikasyon) testleri uygulanır.

Tek koloni ekimi yapılacak her bölge karşıya alınır. baş parmak ve işaret parmak yardımıyla petri kapağı kaldırılır. Petri kabını 4 eşit bölgeye ayırdığımızı düşünürsek birinci bölgeye geniş zikzaklar çizilir. İkinci bölgeye ekim yapılmadan önce öze sterilize edilir ve soğutulur. Birinci bölgeden ikinci bölgeye bir miktar bakteri çekilir. Özenin yakılıp soğutulması üçüncü bölgeye geçmeden önce tekrarlanır. Üçüncü bölgeye ekim yapılır. Öze tekrar ateşten geçirilip boş bir alanda soğutulur. Son olarak üçüncü bölgeye birkaç kez dokunup dördüncü bölgeye zikzak çizerek ekim yapılarak orta alana gelinir.

Petri kabındaki bölgeler arasında her seferinde özenin yıkılmasının sebebi mevcut mikroorganizma sayısını azaltmaktır. İnkübasyonun ardından birinci bölgede yoğun, ikinci ve üçüncü bölgelerde seyrek ve dördüncü bölgede kolonilerin tek tek bulunuşu rahatlıkla gözlemlenebilir.

Kültürler inokülasyon sonrasında etüvde üretime bırakılır ve ardından +4°C’de muhafaza edilebilir ya da liyofilize (dondurarak kurutma) edilebilir.

Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logosu

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Google fotoğrafı

Google hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Twitter resmi

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Facebook fotoğrafı

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Connecting to %s

%d blogcu bunu beğendi: